PMSF通过磺化丝氨酸蛋白酶反应位点的丝氨酸残基中的羟基残基发挥抑制作用，同时，PMSF还可抑制属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶(papain)和哺乳动物的乙酰胆碱酯酶，但不抑制金属蛋白酶、大多数的半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶。PMSF的有效浓度为0.1-1 mM。PMSF是氟磷酸二异丙酯(diisopropylfluorophosphate, DFP)的低毒替代品。PMSF在水中不稳定，建议在使用前添加至裂解缓冲液或其它水溶液中。